BÖLÜM 1/A HÜCRE ZEDELENMES‹ VE HÜCRE ÖLÜMÜ 25 Resim 9.—Kolon mukozas›nda apoptotik hücrelerin TUNEL yöntemi ile gösterilmesi (x100). Resim 10.—Monoklonal antikorlar kullanarak apoptozisin gösterilmesi (x400). Apoptozisin Gösterilmesinde Kullan›lan Yöntemler Ifl›k mikroskopik seviyede rutin hematoksilen-eosin boyal› kesitlerde apoptotik cisimleri saptamak mümkündür. Apoptotik indeks 1000 hücrenin ya da x40 objektifte 1015 alan›n say›lmas› ile belirlenir. Ancak apoptozisin erken safhalar›nda olan hücreleri iskemik nekrozda da görülen karyorektik hücrelerden ay›rmada güçlükler yaflanabilir. Ayr›ca epitelyal yüzeyden lümene dökülen apoptotik hücreleri belirlemek, morfolojileri de¤iflece¤inden güç olabilir. Apoptozis için güvenilir biyokimyasal ya da antijenik bir belirleyici bulunmamakla birlikte, apoptozisi histolojik seviyede belirlemek basit bir histokimyasal reaksiyona dayanan, TUNEL (tdt-mediated nick end labeling technique) ya da ISEL (in situ end labelling) olarak isimlendirilen enzimatik in situ iflaretleme yöntemi ile mümkün olmaktad›r (Resim 9). Bu yöntemde, oluflan DNA k›r›k uçlar›n›n, kimyasal olarak spesifik uçlar olmas› prensibinden yola ç›k›lmaktad›r. Bu uçlara terminal deoksinükleotid transferaz (tdt) enzimi kullan›larak iflaretli nükleotidler eklenmektedir Ancak mitotik hücrelerin de bu yöntem ile boyand›¤›n› ve yalanc› negatif boyanmalar›n gözlendi¤ini bildiren çal›flmalar vard›r. TUNEL yönteminin bir modifiye flekli olan ISNT (in situ nick translation) yönteminde ise, DNA polimeraz enzimi yard›m›yla yine DNA k›r›klar›n›n uçlar›na iflaretlenmifl nükleotidlerin eklenmesi söz konusudur. Apoptozisin saptanmas›nda son y›llarda güncel olan bir yöntem de monoklonal antikorlar›n kullan›lmas›d›r (Resim 10). Burada apoptotik hücrelerin kondanse olan kromatin DNA’ s›n›n termal denatürasyona karfl› artm›fl duyarl›l›¤›ndan yararlan›lmaktad›r. Bu duyarl›l›k DNA’ y› stabilize eden histon yap›s›n›n, apoptoziste enzimatik sindirime u¤ramas›ndan kaynaklanmaktad›r. Termal denatürasyon sonucu oluflan DNA ipli¤i, deoksitidine spesifik monoklonal antikor ile iflaretlenmektedir. Bu yöntem DNA fragmantasyonundan ba¤›ms›z oldu¤undan, apoptozisi belirlemede duyarl›l›¤› di¤er yöntemlerden daha fazlad›r. Sözü edilen yöntemler d›fl›nda flow sitometri ile apoptozisi göstermek mümkünse de, stromal hücre kontaminasyonu istenmeyen bir durum olarak karfl›m›za ç›kmaktad›r. Elektron mikroskopu ise pahal› ve zaman al›c› bir yöntem olmas› nedeniyle apoptozisin gösterilmesinde ender olarak kullan›lmaktad›r. Apoptozisin Klinik Önemi Apoptozisin regülasyonundaki bozukluklar baflta kanser olmak üzere bir dizi hastal›kta patogenetik önem tafl›maktad›r. Bunun yan›s›ra apoptotik süreci yönlendirecek tedavi modellerinin gelifltirilmesi, bu hastal›klar›n do¤al progresyonunu engelleyebilecektir. Human Papilloma Virus (HPV) ile enfekte kanser hücrelerinde, virüsün p53 gen ekspresyonunu inhibe edici etkide protein üretmesi ya da EbsteinBarr virüslerinin kanser hücrelerinde bcl-2 proteinine benzer bir protein salg›lamalar› ile her iki virus apoptozisi bask›lamaktad›r. Ayn› flekilde Apaf-1 ya da Fas ligand› salg›layan tümör hücreleri, sitotoksik T lenfositlerini bloke etmektedirler. Bu bilgilerin ›fl›¤›nda kanser hücrelerinin gerek biyolojik davran›fl ve prognozun belirlenmesi, gerek ise tedavi stratejilerinin oluflturulmas›nda apoptozis ile ilgili çal›flmalar yap›lmaktad›r. Apoptozis morfogenezde de önemli rol oynamaktad›r. Örne¤in parmaklar›n oluflum aflamas›nda, parmaklar aras› perdelerin at›lmas›nda apoptozis ifllev göstermektedir. Bu nedenle sindaktili ve polidaktili gibi konjenital anomalilerde patogenezinde, bu biyolojik olay›n önemi bulunmaktad›r. Ayn› flekilde nöronlar sinaptik ba¤lant›lar yapt›ktan sonra ve organizmadaki prekürsör hücreler görevlerini tamamlad›ktan sonra apoptozis ile ortadan kalkmaktad›r. Spinal muskuler atrofi gibi nörodejeneratif hastal›klarda, bu nedenle apoptozise yönelik araflt›rmalar bulu›nmaktad›r. Bunun yan›s›ra sitotoksik T lenfositlerinin rol ald›¤› lupus eritamatosus ve romatoid artirit gibi pekçok otoimmun hastal›kta, iskemik zedelenmenin yol açt›¤› myokard infarktüsünde ve A‹DS gibi lenfosit y›k›m› olan hastal›klarda apoptozis güncelli¤ini korumaktad›r.